Wissenschaftler der EPFL und des CNR (Nationaler Forschungsrat), der Universität Neapel "Federico II" und des CEINGE - Biotecnologie Avanzate mit Sitz in Neapel (Italien) haben eine neue Methode entwickelt, um einzelne Zellen schnell und zuverlässig ohne Fluoreszenzmarkierung zu screenen. Ihre Arbeit, die in der Zeitschrift Nature Photonics veröffentlicht wurde, eröffnet neue Perspektiven für die frühe Diagnose von Tumoren und die Entwicklung von Medikamenten.
Unter dem Mikroskop kann es sehr schwierig sein, zwischen gesunden und ungesunden Zellen zu unterscheiden. Wissenschaftler verwenden fluoreszierende Farbstoffe oder Marker, die auf bestimmte Proteine abzielen, um Zelltypen zu identifizieren, ihren Zustand zu charakterisieren und die Wirkung von Medikamenten und anderen Behandlungsmethoden zu untersuchen. Trotz ihres entscheidenden Einflusses auf die Medizin hat diese Methode ihre Grenzen. Beispielsweise ist das Markieren von Zellen teuer, zeitaufwendig und hängt stark von den Fähigkeiten der Forscherin oder des Forschers ab. Der Färbeprozess kann auch schädlich für die untersuchten Zellen sein.
Aus diesem Grund haben Wissenschaftler andere Methoden entwickelt, um einzelne Zellen schnell und zuverlässig zu screenen. In einem kürzlich in der Zeitschrift Nature Photonics veröffentlichten Artikel stellen Forscherinnen und Forscher der Fakultät für Ingenieurwissenschaften und -techniken der EPFL und ihre Kollegen vom ISASI (Institut für angewandte Wissenschaft und intelligente Systeme) des CNR in Pozzuoli (Italien) eine farbstofffreie Methode vor, die in der Lage ist, bestimmte Bereiche innerhalb lebender Zellen genau zu unterscheiden. Durch die einzigartige Kombination von holographischer Bildgebung und Mikrofluidik mit der Signalverarbeitung durch neuronale Netzwerke ebnet ihre Arbeit den Weg für Flüssigbiopsien zur Erkennung von zirkulierenden Tumorzellen und für Hochdurchsatztests bei der Arzneimittelprüfung.
Von der Phasenverzögerung zum Brechungsindex
Die Studie stützt sich auf die Lern-Tomographie, eine Methode, die zuvor von Demetri Psaltis und seinem Team am Labor für Optik der EPFL entwickelt wurde. Anstatt ein Mikroskop zu verwenden, um ein visuelles Bild der untersuchten Probe zu erstellen, beruht die Lern-Tomographie auf der quantitativen Phasenabbildung. Dabei handelt es sich um eine holographische Bildgebungsmethode, die die Phasenverzögerung aufzeigt, die entsteht, wenn der Lichtstrahl des Mikroskops durch das Material, aus dem die Zelle besteht, hindurchgeht.
Indem die Wissenschaftler diesen Prozess aus vielen verschiedenen Winkeln wiederholten und die Phasendaten durch ein neuronales Netz leiteten, konnten sie 3D-Karten des Brechungsindexes jedes einzelnen Voxels erstellen - jedes dreidimensionale Volumen, das mit der Methode aufgelöst wurde. "Die Moleküldichte und das Material beeinflussen den Brechungsindex", erklärt Demetri Psaltis. Die Erhöhung der Anzahl der Iterationen hat die Genauigkeit der Schätzung der Brechungsindexverteilung weiter verbessert.
Klassifizierung von Zellbestandteilen
In ihrer Veröffentlichung erklären Demetri Psaltis und sein Team, wie sie eine etablierte Grenze der quantitativen Phasenabbildungsmethoden überwunden haben, nämlich die Unfähigkeit, intrazelluläre Komponenten zu identifizieren. "Die Verwendung einer Autoclustering-Methode, die Voxel mit ähnlichem Brechungsindex gruppiert, in Verbindung mit maschinellen Lernwerkzeugen ermöglichte es uns, die Cluster zu Formen zusammenzusetzen, die wir klassifizieren konnten. Verschiedene Arten von Kernen haben zum Beispiel unterschiedliche Brechungsindizes", sagt Demetri Psaltis. Durch die Schließung dieser Lücke wird der Weg für die quantitative Phasenbildgebung geebnet, die Informationen liefert, die bisher nur mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie möglich waren.
Eine zweite Herausforderung bestand darin, eine Methode zum Screening von Zellen zu entwickeln, bei der diese nicht immobilisiert werden müssen. Die Lösung für dieses Problem kam von Koautor Pietro Ferraro und seinem NRC-Labor, das über umfangreiche Erfahrungen mit der Inbound-Flow-Tomographie mit Hilfe von Lab-on-a-Chip-Geräten verfügt. "Die Idee war, die Zellen in einen fluidischen Kanal mit einem Durchmesser von 50 bis 100 Mikrometern zu geben und den Gradienten der Strömungsgeschwindigkeit des Kanals die Zellen drehen zu lassen", fährt Demetri Psaltis fort. "Indem wir mit einem festen Strahl und Detektor beobachten, wie die Zellen entlang des Kanals fallen, können wir die Phasenverzögerung erkennen, die Orientierung der Zelle abschätzen und unsere lernende Tomographie-Methode anwenden, um die 3D-Brechungsindexkarten zu erstellen."
"Die mögliche Querschnittsauflösung liegt bei einem halben bis einem Mikron", erklärt Demetri Psaltis. "Wir können zwar keine einzelnen Proteine erkennen, aber wir können Proteinaggregate sehen, die tendenziell einige zehn Mikrometer groß sind. Dadurch können wir auch die Größe des Zellkerns und die Kontur der Zelle beurteilen, die weniger glatt ist, wenn die Zellen krebsartig werden." Die Forscherinnen und Forscher validierten ihre Methodik, indem sie ihre Ergebnisse mit Beobachtungen verglichen, die mithilfe der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie, dem derzeitigen Goldstandard für die 3D-Zellbildgebung, gemacht wurden.
Hochdurchsatz-Screening einzelner Zellen
Eine wesentliche Anwendung des farbstofffreien Zellscreenings ist die Flüssigbiopsie. Diese ermöglicht den Nachweis von zirkulierenden Krebszellen und wird zur Identifizierung von Krebsarten in der Chirurgie und als frühes Diagnoseinstrument für Krebsmetastasen verwendet.
Eine weitere Anwendung ist die Entwicklung von Medikamenten. Viele Krankheiten, wie z. B. die Parkinson-Krankheit, werden mit vernetzten Proteinen in Verbindung gebracht. Die von Demetri Psaltis und seinen Kollegen entwickelte Methode bietet eine sehr effektive und nichtinvasive Möglichkeit, die Wirksamkeit von Medikamenten, die für den Abbau dieser vernetzten Proteine entwickelt wurden, in Echtzeit zu bewerten, indem die behandelten Zellen mehrmals durch das Bildgebungsgerät geführt werden. Ebenso könnte diese Methode genutzt werden, um Forscherinnen und Forschern neue Informationen über die Echtzeitwirkung von Krankheitserregern auf gesunde Zellen zu liefern.
Laut Demetri Psaltis wird die zukünftige Arbeit darin bestehen, Werkzeuge des maschinellen Lernens zu verwenden, um biologisch relevante Informationen und konkrete Diagnosen aus der geschätzten Verteilung des Brechungsindex zu extrahieren.
