Aprire la strada all’etichettatura senza coloranti dei componenti cellulari

      -      English  -  Deutsch  -  Français  -  Italiano
Carlo Gigli, ricercatore post-dottorato, e Demetri Psaltis del Laboratorio di OtCarlo Gigli, ricercatore post-dottorato, e Demetri Psaltis del Laboratorio di Ottica © Alain Herzog

Gli scienziati dell’EPFL e del CNR (Consiglio Nazionale delle Ricerche), dell’Università di Napoli "Federico II" e del CEINGE - Biotecnologie Avanzate, con sede a Napoli (Italia), hanno sviluppato un nuovo metodo per analizzare singole cellule in modo rapido e affidabile senza etichettatura a fluorescenza. Pubblicato sulla rivista Nature Photonics, il loro lavoro apre nuove prospettive nella diagnosi precoce dei tumori e nello sviluppo di farmaci.

Al microscopio, distinguere le cellule sane da quelle non sane può essere molto difficile. Gli scienziati utilizzano coloranti o marcatori fluorescenti mirati a proteine specifiche per identificare i tipi di cellule, caratterizzarne le condizioni e studiare l’effetto di farmaci e altri trattamenti. Nonostante il suo grande impatto sulla medicina, questo metodo presenta dei limiti. Ad esempio, l’etichettatura delle cellule è costosa, richiede tempo e dipende in larga misura dalle competenze del ricercatore. Il processo di colorazione può anche essere dannoso per le cellule studiate.

Per questo motivo, gli scienziati hanno sviluppato metodi alternativi per uno screening rapido e affidabile di singole cellule. In un articolo pubblicato di recente sulla rivista Nature Photonics, i ricercatori della Facoltà di Ingegneria e Scienze dell’EPFL e i loro colleghi dell’ISASI (Istituto di Scienze Applicate e Sistemi Intelligenti) del CNR a Pozzuoli, in Italia, presentano un metodo privo di coloranti in grado di distinguere con precisione aree specifiche all’interno delle cellule viventi. Combinando in modo unico l’imaging olografico e la microfluidica con l’elaborazione dei segnali delle reti neurali, il loro lavoro apre la strada alle biopsie liquide per il rilevamento delle cellule tumorali circolanti e ai test farmacologici ad alto rendimento.

Dal ritardo di fase all’indice di rifrazione

Lo studio si basa sulla tomografia dell’apprendimento, un metodo precedentemente sviluppato da Demetri Psaltis e dal suo team presso il Laboratorio di Ottica dell’EPFL. Invece di utilizzare un microscopio per creare un’immagine visiva del campione da studiare, la tomografia di apprendimento si basa sull’imaging di fase quantitativo. Si tratta di un metodo di imaging olografico che rivela il ritardo di fase sperimentato quando il fascio di luce del microscopio attraversa il materiale che costituisce la cellula.

Ripetendo questo processo a diverse angolazioni e facendo passare i dati di fase attraverso una rete neurale, gli scienziati sono stati in grado di creare mappe 3D dell’indice di rifrazione di ogni singolo voxel - ogni volume tridimensionale risolto dal metodo. "La densità delle molecole e il materiale influenzano l’indice di rifrazione", spiega Demetri Psaltis. L’aumento del numero di iterazioni ha migliorato ulteriormente l’accuratezza della stima della distribuzione dell’indice di rifrazione.

Classificazione dei componenti cellulari

Nella loro pubblicazione, Demetri Psaltis e il suo team spiegano come hanno superato una limitazione consolidata dei metodi di imaging quantitativo di fase, ovvero l’incapacità di identificare i componenti intracellulari. "L’uso di un metodo di raggruppamento automatico che raggruppa i voxel con un indice di rifrazione simile, combinato con strumenti di apprendimento automatico, ci ha permesso di assemblare i cluster in forme che abbiamo potuto classificare. Diversi tipi di nuclei, ad esempio, hanno indici di rifrazione diversi", spiega Demetri Psaltis. Colmare questa lacuna apre le porte all’imaging di fase quantitativo, che fornisce informazioni ottenibili solo con la microscopia a fluorescenza.

Una seconda sfida è stata quella di sviluppare un metodo di screening delle cellule che non richiedesse la loro immobilizzazione. La soluzione a questo problema è arrivata dal coautore Pietro Ferraro e dal suo laboratorio del CNR, che ha una vasta esperienza nella tomografia in-flow utilizzando dispositivi lab-on-a-chip. "L’idea era di collocare le cellule in un canale fluidico di 50-100 micron di diametro e lasciare che il gradiente di velocità del flusso del canale facesse ruotare le cellule", continua Demetri Psaltis. "Osservando la caduta delle cellule lungo il canale con un fascio e un rivelatore fissi, possiamo rilevare il ritardo di fase, stimare l’orientamento delle cellule e applicare il nostro metodo di tomografia dell’apprendimento per creare le mappe 3D dell’indice di rifrazione".

"La risoluzione trasversale possibile va da mezzo micron a un micron", spiega Demetri Psaltis. "Non possiamo rilevare le singole proteine, ma possiamo vedere gli aggregati proteici, che tendono a misurare qualche decina di micron. Questo ci permette anche di valutare le dimensioni del nucleo e il contorno della cellula, che è meno regolare quando le cellule diventano cancerose". I ricercatori hanno convalidato la loro metodologia confrontando i risultati con le osservazioni effettuate con la microscopia confocale a fluorescenza, l’attuale gold standard dell’imaging cellulare 3D.

Screening di singole cellule ad alta produttività

Un’applicazione chiave dello screening cellulare senza coloranti è la biopsia liquida. Questo permette di rilevare le cellule tumorali circolanti e viene utilizzato per identificare i tipi di cancro in chirurgia e come strumento di diagnosi precoce per le metastasi del cancro.

Un’altra applicazione è lo sviluppo di farmaci. Molte malattie, come il morbo di Parkinson, sono associate a proteine reticolate. Il metodo sviluppato da Demetri Psaltis e colleghi offre un modo altamente efficiente e non invasivo per valutare l’efficacia dei farmaci progettati per rompere queste proteine reticolate in tempo reale, facendo passare ripetutamente le cellule trattate attraverso il dispositivo di imaging. Allo stesso modo, questo metodo potrebbe essere utilizzato per fornire ai ricercatori nuove informazioni sugli effetti in tempo reale degli agenti patogeni sulle cellule sane.

Secondo Demetri Psaltis, il lavoro futuro prevede l’utilizzo di strumenti di apprendimento automatico per estrarre informazioni biologicamente rilevanti e diagnosi concrete dalla distribuzione dell’indice di rifrazione stimato.